分子生物学技术的发展对现代生命科学的影响
信息来自:第一文库网(www.wenku1.com) · 作者:李建飞 · 日期:07-12-2016

 

姓名:李建飞

专业:植物学

学号:S110916

指导教师:周宜君

浅谈PCR技术和克隆技术在遗传疾病诊断中的应用

分子生物学技术的发展对现代生物科学发展的影响

分子生物学(molecular biology)是从分子水平上研究生命现象物质基础的学科。研究细胞成分的物理、化学的性质和变化以及这些性质和变化与生命现象的关系,如遗传信息的传递,基因的结构、复制、转录、翻译、表达调控和表达产物的生理功能,以及细胞信号的转导等。[1]分子生物学技术就是以分子生物学为基本知识基础,结合现代技术以研究分子水平变化的新技术,其中包括基因克隆,real-timePCR,转基因技术,SNP分析技术,RSLP分析技术,RACE技术,双向电泳技术(IEF和SDS-PAGE),质谱分析技术,western blotting,原位杂交技术,基因芯片,蛋白质组芯片,酵母单杂交、酵母双杂交技术,以及近几年来发展起来的生物信息学分析和RNAi技术。分子生物学技术发展日新月异,该技术的发展已经在整个生物学领域占据了主导作用,相关技术的应用已经成为推动相关学科发展的必要手段。分子生物学技术能有今天的地位也是取决于它研究对象的基础性和根本性。下面将谈谈分子生物学技术在现代生物科学发展的具体影响。

遗传疾病从分子水平解释,究其根源是由于与正常个体的遗传分子相比,患有遗传疾病个体的遗传物质发生了DNA序列或染色体片段上的改变。这种遗传物质上的异常在向后代传递时遵循孟德尔遗传规律而可遗传给下一代。具体讲,较常见的突变情况有如下几种:(1)染色体某个区域的缺失;(2)某个基因的部分外显子或内含子的缺失;(3)基因的单碱基突变;(4)三核苷酸重复突变;(5)基因的一部分重复转录,而导致基因产物大小的改变;(6)插入突变,从基因组其他部位的DNA片段插入到目的DNA序列内;(7)线粒体基因组的突变[2~5]。

应用分子生物学技术检测遗传疾病,又称遗传疾病基因诊断,是在分子水平上对核苷酸序列的突变进行检测,以在遗传物质的分子水平揭示疾病的发病机理和发病根源。分子生物学技术在人类遗传疾病诊断中的应用是近年来分子生物学理论和技术手段不断发展和成熟并在社会生活中逐步运用、普及的结果。一般来讲,遗传疾病的分子突变机制都比较复杂,往往包括上述的两种或两种以上的情况,如导致新生儿失盐症的212羟化酶缺乏症,可由于212羟化酶基因(P450c21) 发生缺失或基因易位插入所致[6];杜氏肌营养不良症(Duchenne muscular dystrophy,DMD)是由于抗肌萎缩蛋白(dystrophin)基因的部分缺失和重复造成[7]。

运用分子生物学方法诊断遗传疾病是近几十年发展起来的一个新的领域。遗传疾病基因诊断技术发展的第二阶段是在1985年美国人KaryB.Müllis等创建聚合酶链反应(polymerase chainre2action,PCR)之后。由于PCR技术只需要简单的操作就可在普通实验条件下使所需要的靶DNA序列在短时间内得到大量扩增,从而突破了在以往研究中不易获取丰富量靶DNA的瓶颈,在分子生物学技术领域引起了一场革命。PCR技术于由其适用性强、操作方便、快捷,已广泛应用于遗传疾病基因诊断领域。以PCR技术为基础,衍生出了许多灵敏而便捷的基因诊断方法,较成熟的方法主要有:PCR2RFLP方法,是检测与特定的酶切位点有关的突变的简便方法;等位基因特异性PCR(allele specific PCR,AS2PCR),该方法针对等位基因序列设计引物,可根据PCR产物的有无来鉴定基因型;PCR单链构型多态性技术(single strand conformational polymor2phism ,PCR2SSCP)[9],该方法在PCR 产物变性后,在非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳,PCR产物的序列中碱基突变可使DNA分子构型产生差异,而在电泳中的迁移率有所改变,从而可以揭示PCR产物序列内的多态性;多重荧光PCR2STR(simple tandem repeat,STR)可用于检测与微卫星多态性遗传标记连锁的遗传疾病。PCR技术和蛋白质免疫技术结合出现了新型的免疫PCR基因探针[11~13]。用特殊的具有共价结合能力的分子,如生物素———亲合素、叶绿素等连接蛋白质和核酸,构成了有特异性抗性的抗体基因探针。这一复合型的探针可对基因的表达产物进行诊断。在实际操作中复合型探针的抗体部分特异性地与目的基因表达产物结合,洗脱不能结合的探针,对探针的基因部分进行PCR扩增,根据PCR产物的有无来检测是否存在目的基因的表达产物。免疫PCR基因探针集中了免疫反应的高度特异性和PCR反应的高度灵敏性,检测灵敏度比ELISA高104~105[14]。该技术目前虽仍处于研究阶段,但它为遗传疾病的检测提供了新的思路和方法,具有较好的应用前景。近年来,一种新物质——肽核酸,逐步应用于PCR检测,为以PCR技术为基础的检测方法开辟了新领域。

在50年中,分子生物学是生命科学范围发展最为迅速的一个前沿领域,并推动着整个生命科学的发展。分子生物学已建立的基本规律给人们认识生命的本质指出了光明的前景,但分子生物学的发展还要经历漫长的研究道路。在地球上千姿百态的生物携带庞大的生命信息,迄今人类所了解的只是极少的一部分,还未认识核酸、蛋白质组成生命的许多基本规律;即使我们已经获得人类基因组[10][8]

DNA3×109bp的全序列,确定了人基因的一级结构,但是要彻底搞清楚这些基因产物的功能、调控、基因间的相互关系和协调,要理解80%以上不为蛋白质编码的序列的作用等等,都还要经历艰辛的研究道路。随着分子生物学的发展和人类对生命的认识,21世纪分子生物学的发展将进入一个新时代。
 

参考文献

[1] http://baike.baidu.com/view/2461.htm。

[2] Korf B. Molecular diagnosis (first of two parts) [J ] . N Engl J Med ,1995 ,332 (18) :1218.

[3] Schwaretz R S. Jumping genes[J ] . N Engl J Med ,1995 ,332 (14) :941.

[4] 蒋秉坤. 线粒体DNA 和疾病[J ] . 生物化学与生物物理进展,1995 ,22(1) :18.

[5] 牟奕,单祥年,严明,等. 一个母系遗传非综合征耳聋大家系mtDNA序列分析[J ] . 遗传,2001 ,23 (5) :401~405.

[6] Bristow J ,Tee M K, et al . Tenascin2X:a novel extracellular matrix pro2tein encoded by the human XB gene overlapping P450c21B[J ] . J CellBiol ,1993 ,122 (1) :256~278.

[7] Perlin M W,Burks M B , et al . Toward fully automated genotyping :al2lele assignment ,pedigree construction ,phase determination ,and recom2bination detection in Duchenne muscular dystrophy [ J ] . Am J HumGenet ,1994 ,55 :777~787.

[8] UgzzoliL ,Wallace R B. Allele2specific polymerase chain reaction[J ] .Methods ,1991 ,2 :42~48.

[9] Suzuki Orita M Y,SekiyaT,Hayashi K. Rapid and sensitive detectionof point mutations and DNA polymorphisms using the polymerase chainreaction[J ] . Genomics ,1989 ,5 :874~879.

[10] Prior T W, Papp A C. et al . Deter mination of carrier status inDuchenne and Becker muscular dystrophies by quantitative polymerasechain reaction and allele2specific oligonucleotides [ J ] . ClinChem ,1990 ,36 :2113~2117.

[11] Sano T,Smith C L ,Cantor C R. Immuno2PCR: very sensitive antigendetection by means of specific antibody2DNA conjugates [J ] . Science ,1992 ,258 :120~122.

[12] SanotT,Smith C ,Cantor CR. Immuno2PCR with a commercially avail2able avidin system[J ] . Science ,1993 ,260~699.

[13] Edwin R H ,Tina M H T,Rolf D J , et al . High sensitive multianalyteimmunoassay using covalent DNA2labelled antibodies and polymerasechainreaction[J ] . Nucleic Acids Res ,1995 ,23 :522~529.

[14] 乔生军,吴自荣,戚蓓静. 一种新型免疫PCR 基因探险针的构建及其在诊断中的初步研究[J ] . 中国科学(C 辑) ,1998 ,28(1) :77~82.

 

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